在生物医学领域，样本的采集与保存是进行ELISA（酶联免疫吸附试验）测定的重要环节。可供使用的样本种类繁多，包括体液（如血清）、分泌物（如唾液）和排泄物（如尿液和粪便），这些样本均可用来分析其中的抗体或抗原成分。某些样本（如血清和尿液）可以直接测定，而其他样本（如粪便和某些分泌物）可能需要预处理。通常，ELISA检测主要以血清为样本。此外，血浆虽然包含纤维蛋白原和抗凝剂，但在功能上与血清相似。血浆样本的制备需要使用抗凝剂，而血清样本则通过自然凝固并收缩形成的血块获取。通常，医学检验中主要使用血清作为检测样本，但在ELISA中，血浆和血清是可以互换使用的。

在采集血清时，需要注意预防溶血现象，因为红细胞破裂会释放具有过氧化物酶活性的物质，这可能会在以HRP（辣根过氧化物酶）标记的ELISA中导致非特异性显色。血清样本应在新鲜状态下进行检测，如果存在细菌污染，可能导致假阳性反应。此外，过长时间的冷藏可能会导致样本中的蛋白质发生聚合，影响检测结果。通常建议在5天内将血清样本存放在4℃的环境中，超过一周则需以低温冷冻保存。冻结的血清在解冻后，需充分混合以避免局部浓缩和分布不均。在反复冻融过程中，抗体效价可能会下降，因此为了进行多次检测，建议将血清样本分装保存。同时，在采集和保存过程中应遵循严格的无菌操作，并可考虑添加适当的防腐剂以确保样本品质。

在准备试剂时，应根据试剂盒的说明书进行操作。用于ELISA的蒸馏水或去离子水应为新鲜且高质量的。自制的缓冲液需使用pH计进行测量以确保准确。实验所需的试剂在使用前应达到室温，未使用的试剂应立即放回冰箱保存。

在ELISA中，一般有三次加样步骤：加样本、加酶结合物和加底物。加样时，需将样本加至ELISA板孔的底部，避免碰到孔壁，并注意防止溅出和气泡的产生。使用微量加样器按规定加入样本时，每次更换吸嘴以避免交叉污染，或者使用一次性定量塑料管进行加样。如果测定中需要稀释血清，可事先在试管中按照规定的稀释度稀释，随后再进行加样处理。加入酶结合物和底物时，使用定量多道加液器可以提高加样的效率。

ELISA中的抗原抗体反应通常有两个主要阶段，分别是在加样本和加酶结合物后进行的。反应的完成需要特定的温度和时间，这个过程中称为温育。虽然有时称之为孵育，但在ELISA中这一说法可能并不准确。结合于固相表面的抗原和抗体只会在固相上发生结合，其中的抗原不可能均匀接触到固相抗体，因此需通过扩散来实现反应的平衡。常用的温育温度有4℃、室温、37℃和43℃等。37℃被广泛应用，因为这是大多数抗原抗体结合的最佳温度，通常需要1到2小时以达到反应的顶峰。而在ELISA反应中，若温度偏高，通常不建议超过43℃，同时在4℃的条件下进行反应也更为彻底，尽管这一过程一般在ELISA中不常采用，原因是所需时间较长。

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